GH3貼壁培養(yǎng)細(xì)胞株優(yōu)惠大 "

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傳代細(xì)胞培養(yǎng)：原代細(xì)胞或細(xì)胞株或細(xì)胞系需在體外持續(xù)地培養(yǎng)就傳代，以便獲得穩(wěn)定的原代細(xì)胞或細(xì)胞株或細(xì)胞系或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)，這個過程體外培養(yǎng)稱為傳代細(xì)胞培養(yǎng)。一般認(rèn)為，細(xì)胞培養(yǎng)形成單層匯合，細(xì)胞密度與生存空間有密切的關(guān)系，將培養(yǎng)細(xì)胞分散，以1:2或l:3或1:4以上的比率轉(zhuǎn)移分散進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過三個階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。
常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)/100個細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細(xì)胞可達(dá)3～5％。細(xì)胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力好時期，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期)，適宜進(jìn)行各種試驗。
傳代細(xì)胞的培養(yǎng)：（1）吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。（2）每瓶加入2mL,無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。（3）每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2~3分鐘，輕輕搖動，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時應(yīng)立即終止消化。（4）加入完全培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷。（5）用計數(shù)板計數(shù)，計算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。
傳代細(xì)胞的建系和維持
1、細(xì)胞檔案：細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時間、擴(kuò)增時間（分裂指數(shù)），細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志（標(biāo)記染色體）等，這些記錄對于細(xì)胞的正常生長，保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。
2、換液傳代：（1）細(xì)胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。（2）多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細(xì)胞種子均應(yīng)凍存。傳代時均應(yīng)作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記，標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時間。細(xì)胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異，此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時進(jìn)行對比試驗。" "

購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復(fù)雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸渾細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；細(xì)胞置于-80℃太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作。
欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為300×g(約1OOOrpm),5-10分鐘，轉(zhuǎn)速過高或離心時間過長都將造成細(xì)胞死亡。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對離心力決定。RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部內(nèi)壁的距離；rpm為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)；RCF(relative centrifugal force)為相對離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示單位。
為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時傳代？體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代后，細(xì)胞的生長得以繼續(xù)。
培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢的原因在哪些?其解決辦法有哪些？可能的原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨眈肢或生長因子等耗盡或缺乏或己被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清等，找出其它可能的原因。
解決辦法：增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度；讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補(bǔ)加谷氨酷肢或生長因子等；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，去棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌；血清需保存在5℃到20℃; 培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存;含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內(nèi)用完;分離培養(yǎng)物，檢測支原體。
冷凍管應(yīng)如何解凍？取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1-2分鐘內(nèi)大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細(xì)胞，用75%酒精消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。" "

傳代培養(yǎng)及其操作步驟：原代細(xì)胞培養(yǎng)成功以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞允許培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株)，可以進(jìn)行細(xì)胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細(xì)胞和分化特征。傳代細(xì)胞形成細(xì)胞株的大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。
傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟：（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，2-5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細(xì)胞。（6）用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。（7）細(xì)胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2-3d后應(yīng)換一次生長液。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。
傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項：（1）掌握好細(xì)胞消化的時間，消化時間過短時，細(xì)胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷。（2）掌握好消化濃度，當(dāng)消化液濃度過高時，消化時間應(yīng)縮短，過低時細(xì)胞消化時間相對延長。
體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)及其操作步驟：瘤細(xì)胞懸液接種（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細(xì)胞。（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細(xì)胞懸液。（3）培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用PBS洗兩遍。（4）計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至10(7)～10(8)/ml。（5）常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細(xì)胞懸液(0.1ml/部位，＞10(6)細(xì)胞)。初次接種成功率低，細(xì)胞數(shù)盡可能多一些。（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。
腹水瘤的建立與腹水瘤的接種：將實體瘤細(xì)胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細(xì)胞，將這種腹水反復(fù)傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時，腹水常呈血性(含大量紅細(xì)胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細(xì)胞離心和洗滌，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。（2）消毒動物，左下腹穿刺接種1×10(6)腹水瘤細(xì)胞。（3）接種腹水瘤細(xì)胞后約7-12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3-5ml。（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆谩?br /> 培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇：細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。
凍存細(xì)胞：（1）選對數(shù)增生期細(xì)胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×10(7)/ml左右密度，離心，去上清。（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)記。（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃/min的速度，在30～40min時間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。操作時應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
復(fù)蘇細(xì)胞：（1）從罐中取出凍存管。（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其融化，30～60s內(nèi)完成。（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。（4）低速離心(500～1000r/min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達(dá)到10(7)/ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×10(5)/ml數(shù)量。" "

公司已合作單位有山西中醫(yī)學(xué)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、上海市第六人民醫(yī)院、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部、四平中心醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)、中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞研究所、解放軍第306醫(yī)院、江南大學(xué)、西南醫(yī)院、吉首大學(xué)、西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院、寧波大學(xué)、福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、中南大學(xué)、延安大學(xué)附屬醫(yī)院、中國科學(xué)院上海藥物研究所、天津市兒童醫(yī)院、江蘇省中醫(yī)藥研究院、湘雅醫(yī)學(xué)院、第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防系勞動與環(huán)境教研室、揚州大學(xué)、上海交通大學(xué)、中國醫(yī)科大學(xué)、浙江省立同德醫(yī)院、中國人民解放軍第150中心醫(yī)院、蘇州大學(xué)、四川大學(xué)華西醫(yī)院、云南大學(xué)、揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院、江蘇腫瘤醫(yī)院、上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、沈陽藥科大學(xué)、廣州市第八人民醫(yī)院、南京大學(xué)、浙江中醫(yī)藥大學(xué)、蘭州大學(xué)、上海中醫(yī)藥大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所、廈門市婦幼保健院、重慶大學(xué)、南京軍區(qū)總醫(yī)院、天津市人民醫(yī)院、北京醫(yī)學(xué)科學(xué)腫瘤醫(yī)院、江蘇大學(xué)、桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、中國科學(xué)院化學(xué)研究所、、鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院、湖北省人民醫(yī)院、四川大學(xué)華西第二醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、青海紅十字醫(yī)院、廣州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、北京紅十字朝陽醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院、江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院、山西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、上海長海醫(yī)院、北京阜外醫(yī)院、北京安貞醫(yī)院、上海遠(yuǎn)大心胸醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院、廣東霍英東心臟中心、中山醫(yī)科大學(xué)中山眼科中心、天津眼科醫(yī)院、溫州醫(yī)學(xué)院附屬眼視光醫(yī)院、北京兒童醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院、湖北十堰市太和醫(yī)院、濟(jì)南市兒童醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院" "

C4140 HeLa[Chang Liver]張氏肝貼壁細(xì)胞株
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C4225 NCI-H1755[H1755]人肺癌貼壁細(xì)胞株
C4226 NCI-H838[H838]人肺癌貼壁細(xì)胞株
C4227 NCI-H1563[H1563]人胚肺貼壁細(xì)胞株
C4228 NCI-H2170[H2170]人肺鱗狀四代細(xì)胞癌
C4230 SW 1271[SW-1271 SW1271]人肺腺癌貼壁細(xì)胞株
C4231 NCI-H1703[H1703]人肺癌貼壁細(xì)胞株
C4232 NCI-H226[H226]人肺癌貼壁細(xì)胞株
C4233 NCI-H1869[H1869]人肺癌貼壁細(xì)胞株
C4234 SW 900[SW-900 SW900]人肺癌貼壁細(xì)胞株
C4303 HEK-293Ad5DNA轉(zhuǎn)化的胚腎
C4310 G401人腎癌Wilms貼壁細(xì)胞株
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C4402 ZR75-30人貼壁細(xì)胞株
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C4417 UACC812人乳腺導(dǎo)管瘤貼壁細(xì)胞株
C4426 AN3 CA人子宮內(nèi)膜腺癌貼壁細(xì)胞株
C4429 HeLa229人宮頸癌四代細(xì)胞(HPV-18 永生化四代細(xì)胞)
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C4441 RWPE2人前列腺上皮貼壁細(xì)胞株
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C4529 JurkatClone E6-1T 淋巴四代細(xì)胞白血病貼壁細(xì)胞株
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C5025 VERO E6猴腎四代細(xì)胞系
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C5066 CHO/dhFr-中國倉鼠腎四代細(xì)胞(二氫葉酸還原酶缺陷型)
C5070 EMT6小鼠乳腺
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C5093 CHL/IU[CHL-11]中國倉鼠肺貼壁細(xì)胞株"